Мягкая рентгеновская микроскопия

Мягкая рентгеновская микроскопия на основе многослойных зеркал  для биологических применений

В последние 30 лет активно развивается рентгеновская микроскопия в “окне прозрачности воды”. Это диапазон длин волн от 2.3 нм до 4.4 нм.  Этот диапазон замечателен тем, что в нем есть естественный контраст между углеродосодержащими структурами и водой. Контраст возникает из-за разницы глубины проникновения в воду и белок, которая составляет  10 мкм [1]. Поэтому существует интерес к данной области рентгеновского излучения, для исследования биологических объектов без дополнительного окрашивания образцов, что позволяет наблюдать их в естественной форме.

Рисунок 1. Зависимость глубины проникновения от длины волны для углеродосодержащих структур и воды.

В настоящее время существует определенное количество «мягких» рентгеновских микроскопов, которые в основном находятся на источниках синхротронного излучения, но есть и лабораторные микроскопы. Все эти микроскопы без исключения используют в качестве изображающей оптики зонные пластины Френеля. Зонные пластины имеют высокое латеральное разрешение, но низкое аксиальное (вдоль оптической оси системы) из-за большой глубины фокуса, и как следствие размытия вдоль оптической оси.

Рисунок 2. Зонная пластина Френеля (слева) и объектив Шварцшильда (справа).

От этой проблемы можно уйти, используя многослойную рентгеновскую оптику нормального падения в конфигурации объектива Шварцшильда с высокой числовой апертурой. Чем больше числовая апертура, тем меньше размытие вдоль оптической оси. Другими словами зеркальный объектив передаёт точку в точку.

Но вытекают следующие проблемы.  Чем меньше длина волны, тем жестче требования к форме поверхности оптических элементов. Ошибка формы поверхности (латеральный размер миллиметры) должна быть не хуже  λ/8 по средне  квадратической ошибке (СКО) для высокочастотных аберраций и не хуже λ/14 для низкочастотных, поэтому требования к форме нанометровые для длин волн в диапазоне 3-14нм. Требования к шероховатости (латеральный размер микроны) – субнанометровые.

Поэтому при изготовлении оптических элементов  мы используем несколько подходов для улучшения качества формы поверхности. Первоначально мы используем методику механического притира оптического элемента. То есть происходит полировка заготовки зеркала различными абразивными суспензиями[2]. После чего производится измерения формы поверхности при помощи интерферометра с дифракционной волной сравнения, разработанного нами, основные принципы которого описаны в работах [3-4]. В данном примере, на рисунке 3, после механического притира порошками с микронными и субмикронными зернами СКО формы уменьшилась с 36 нм до 3.3 нм.

Рисунок 3. Фото обрабатываемой подложки (слева) и карта формы поверхности до и после полировки (справа).

После ручной полировки происходит процесс полировки ионный пучком, для дальнейшего уменьшения СКО. Основная суть метода заключается в следующем. Берётся карта формы поверхности зеркала (как приведено на рисунке 3), и её бугры (оранжевый, жёлтый цвет) стравливаются ионным пучком. Тем самым можно уменьшить СКО до субнанометрового масштаба. [5]

Рисунок 4. Фото установки ионно-пучкового травления. Общий вид (слева) и фото внутри (справа).

После финальной обработки заготовки, на нее напыляется многослойное рентгеновское  зеркало под нужную длину волны и изготавливаются параллельно под этот же диапазон свободно висящие рентгеновские фильтры, для отсечения паразитного излучения. 

В итоге всё готово для сборки рентгеновского микроскопа. Все монтируется в вакуумной камере, чтобы рентгеновское излучение не поглощалось в воздухе, и производится настройка оптической системы так же при помощи интерферометра с дифракционной волной сравнения.  Если опустить дальнейшие технические подробности всей конструкции микроскопа, то в принципе прибор готов к работе для наблюдения биологических объектов и восстановления их 3D структур.

Рисунок 5. Схема микроскопа:  1) лазерно-плазменный источник на основе газовой мишени и ИК-лазера, 2) многослойное зеркало-коллектор, 3) исследуемый образец на 5D-столике с возможностью z-скана в вакууме, 4) двухзеркальный объектив 47 (или 350) крат с асферическим зеркалом М1, поле зрения 300х300х30мкм, 5) фильтры для подавления длинноволнового излучения, 6) ПЗС-камера 10) пружинный подвес, 13) стол, 14) вакуумная откачка

Как работает микроскоп: в качестве источника мягкого рентгеновского излучения служит лазерная плазма, которая генерируется вследствие взаимодействия сфокусированного лазерного излучения на длине волны 1064 нм с газовой мишенью. В качестве мишени используется сверхзвуковая газовая струя аргона, которая формируется при помощи импульсного сопла. Далее излучение от лазерной плазмы собирается коллектором и фокусируется на образце. После чего излучение, прошедшее через образец, собирается на ПЗС камере при помощи двух (трёх) зеркального объектива Шварцшильда. В данной конфигурации существует возможность перемещение образца удалённо на пьезокерамическом актуаторе вдоль оптической оси для получения изображений разных z-срезов образца по глубине. После съёма серии изображений по глубине производится деконволюция (3D-реконструкция) полученных изображений с функцией рассеяния точки объектива. Это позволяет учесть остаточные аберрации объектива и поглощение излучения внефокусными срезами.

Ну и в качестве примера приведем некоторые восстановленные изображения, полученные на нашем микроскопе в сравнении с оптическим микроскопом.

Рисунок 6. Изображение химически фиксированного среза стебля ландыша на оптическом микроскопе Zeiss LSM 880 (слева) и на рентгеновском микроскопе на длине волны 13.84 нм (справа).

Как итог за счёт уменьшения длины волны при переходе из видимого в сторону мягкого рентгеновского диапазона латеральное и объёмное выросли в 2 раза по сравнению с «видимым светом».

Рисунок 7. Изображение 0.5х150х80 мкм^3 химически фиксированного среза клеток мозга мыши, полученное на ЭУФ-микроскопе на 13.84 нм.

Разработанный ЭУФ-микроскоп продемонстрировал уникальные возможности многослойных зеркал и фильтров, разрабатываемых в России.  На нём получены изображения с латеральным разрешением 140 нм и аксиальным разрешением 600 нм, что находится на мировом уровне для такого типа микроскопов. Также впервые в мире на таком типе микроскопов продемонстрирована возможность z-томографии для реконструкции трёхмерных изображений.

Дальнейшие планы: добавление 3го зеркала для повышения разрешающей способности микроскопа до 20-40нм, а также переход на другую длину волны в «окне прозрачности воды» для реализации возможности наблюдения живых водосодержащих клеток с разрешением до 20 нм.    

1. J. Kirz, et al. Q. Rev. Biophys. 28, 33-130 (1995).
2. М.Н. Торопов, А.А. Ахсахалян, М.В. Зорина, Н.Н. Салащенко, Н.И. Чхало, Ю.М. Токунов, Получение гладких высокоточных поверхностей методом механического притира, Журнал технической физики, 2020, том 90, вып. 11 DOI: 10.21883/JTF.2020.11.49990.127-20
3. A.A. Akhsakhalyan, N.I. Chkhalo, N. Kumar a, I.V. Malyshev, A.E. Pestov, N.N. Salashchenko, M.N. Toropov, B.A. Ulasevich, S.V. Kuzin, Compact high-aperture interferometer with a diffractive reference wave for high-precision referenceless aberration measurements of optical elements and systems, Precision Engineering 72 (2021) 330–339, https://doi.org/10.1016/j.precisioneng.2021.05.011
4. N. I. Chkhalo, I. V. Malyshev, A. E. Pestov, V. N. Polkovnikov, N. N. Salashchenko, M. N. Toropov, and A. A. Soloviev, Problems in the application of a null lens for precise measurements of aspheric mirrors, Applied Optics, Vol. 55, Issue 3, pp. 619-625, (2016), https://doi.org/10.1364/AO.55.000619
5. И.Г. Забродин, М.В. Зорина, И.А. Каськов, И.В. Малышев, М.С. Михайленко, А.Е. Пестов, Н.Н. Салащенко, А.К. Чернышев, Н.И. Чхало, Ионно-пучковые методики прецизионной обработки оптических поверхностей, Журнал технической физики, 2020, том 90, вып. 11, DOI: 10.21883/JTF.2020.11.49985.112-20